Лабораторна діагностика кандидозу

Кандидоз – один із найбільш часто реєструємих мікозів, що викликається умовно-патогенними грибами Candida spp., збудниками опортуністичних інфекцій. Характеризується наявністю гострих і хронічних форм і різноманітністю клінічних проявів, включно з ураженням слизових оболонок, шкіри, внутрішніх органів і систем організму. Прояви інфекції варіюють від легких форм поверхневого кандидозу до інвазивних процесів із високою летальністю (10-70 %).

Клінічні форми кандидозу можна згрупувати наступним чином:

Поверхневі кандидози (шкіри, хронічний кандидоз шкіри та слизових оболонок, оніхомікоз, орофарингеальний кандидоз, кандидозний вульвовагініт, кератит, кон’юнктивіт).
Глибокий інвазивний кандидоз:
1. При місцевому зараженні (езофагіт, кандидоз шлунково-кишкового тракту, сечовидільного тракту, включно з циститом, нирковим абсцесом і пієлітом, перитонітом/інтраабдомінальним абсцесом);
2. Гематогенно-дисемінований кандидоз (кандидемія, хронічний дисемінований кандидоз, гнійний флебіт, ендокардит, менінгіт, ендофтальміт, артрит, остеомієліт).

Оскільки деякі види Candida spp. є мешканцями мікробіома, їх можна виявляти під час посівів зі слизової оболонки порожнини рота і шлунково-кишкового тракту у 30-50 % здорових людей, а також зі слизової оболонки статевих органів у 20-30 % здорових жінок. Тому важливо вміти розрізняти кандидоз і колонізацію слизових оболонок або шкіри. З іншого боку, нерідко ознаки захворювання виявляють занадто пізно, а багато грибкових інфекцій відрізняються дуже швидким і агресивним перебігом.

Інвазивний кандидоз зазвичай виникає як внутрішньолікарняна інфекція у хворих із факторами ризику та характеризується тяжкістю клінічних проявів і високою летальністю (до 70 %).

Основні фактори ризику розвитку клінічних форм кандидозів

Колонізація кількох локусів тіла
Застосування антибіотиків широкого спектра дії
Імуносупресія
Зниження кількості та порушення функції нейтрофільних лейкоцитів і Т-лімфоцитів з різних причин (у тому числі СНІД)
Опіки, травми, хірургічні втручання
Парентеральне харчування
Гемодіаліз
Індекс за системою APACHE 11 ˃ 20 балів
Використання катетерів (венозних, сечових, перитонеальних), штучна вентиляція легень
Ендокринні захворювання (діабет)
Злоякісні новоутворення
Недоношеність (вага менше 1,5 кг)
Трансплантація органів і тканин
Тривале перебування у ВРІТ (˃ 7 днів)

Збудники

Рід Candida spp. був описаний у 1923 р. мікологом Christin Marie Berkhout (1893-1932). Із приблизно 300 відомих видів Candida до основних збудників людини відносять 20 видів (табл. 1).

Незважаючи на те, що понад 90 % інвазивних кандидозів визначаються п’ятьма основними видами, перелік можливих збудників продовжує зростати з накопиченням досвіду і можливостей лабораторій в ідентифікації грибів. Це дуже важливо для оптимізації терапії кандидозних інфекцій. Протягом останніх років спостерігається тенденція зсуву спектра збудників інвазивного кандидозу в бік non-albicans видів Candida, для яких характерна знижена чутливість до антимікотиків.

Зараз дедалі частіше описують новий збудник із множинною лікарською стійкістю, що спричиняє внутрішньолікарняні та інвазивні інфекції, пов’язаний із високим рівнем смертності – Candida auris. Перший штам гриба було ізольовано із зовнішнього слухового проходу пацієнта в Японії 2009 року. Основна особливість нового збудника – здатність передаватися від пацієнта до пацієнта. Дані з Центрів по контролю і профілактиці захворювань (Centers for Disease Control and Prevention) свідчать, що нові випадки інфекції Candida auris реєструються майже щодня і в окремих країнах мають характер спалахів. Найчастіше інфекція протікає у формі хронічного середнього або зовнішнього отиту, ураження м’яких тканин і раневої інфекції, кандидурії, а також інфекції Candida auris системного кровотоку.

Діагностика

Мікроскопічні гриби є представниками окремого царства живих істот і значно відрізняються від інших збудників інфекцій. Тому необхідні особливі підходи до діагностики та лікування мікозів. Клінічні ознаки часто неспецифічні, особливо в імуноскомпроментованих пацієнтів. Рентгенографічні та комп’ютерно-томографічні ознаки інвазивних мікозів також недостатньо специфічні. Обов’язковою умовою правильної діагностики є виявлення збудника за допомогою мікологічних, молекулярно-генетичних або серологічних методів.

Для ефективної діагностики та лікування мікозів лікарі повинні не тільки знати їхні клінічні, інструментальні та лабораторні ознаки, а й уміти планувати діагностичні заходи та правильно оцінювати отримані результати.

Види досліджуваного матеріалу, його отримання і транспортування

Гриби роду Candida вражають різні органи і тканини людини. Це визначає значну різноманітність патологічного матеріалу: кров, сеча, харкотиння, виділення слизових оболонок, біоптатів, катетерів тощо, який необхідно використовувати при підозрі на кандидоз.

Обов’язковою умовою успішного дослідження є взяття матеріалу безпосередньо з осередків ураження в асептичних умовах.

Мокротиння, виділене під час відкашлювання, збирають у стерильну баночку, бажано з кришкою, що закручується. Слід досліджувати ранкову порцію мокротиння, яка являє собою секрет легень. Попередньо хворому необхідно ретельно почистити зуби і тричі прополоскати ротову порожнину і зів 2 % розчином питної соди, 2 % розчином бури, розчином марганцевокислого калію (злегка рожевого кольору) або стерильним фізіологічним розчином.

Промивні води бронхів, гайморових порожнин, плевральний ексудат, шлунковий сік і жовч (порції А, В і С), спинномозкову рідину збирають у стерильні пробірки.

Сечу (середня або остання порція) збирають після ретельного туалету зовнішніх статевих органів у кількості 10-15 мл у стерильні банки з кришкою, що закручується.

Фекалії (остання порція) збирають стерильно в баночку з кришкою, що закручується, в кількості 10-15 г.

Виділення свищів (гнійне і серозне) у разі рясного виділення можна збирати в стерильні пробірки. За незначної кількості виділень матеріал збирають тампоном. Пастерівською піпеткою або бактеріологічною петлею.

Виділення слизових (ротової порожнини, мигдалин, піхви, цервікального каналу, кон’юнктиви очей, носа) збирають тампоном, який вносять у суху стерильну пробірку або пробірку з 2 мл рідкого поживного середовища. Для мікроскопії можна використовувати зішкріб білувато-сірих нальотів слизових.

Кров на гемокультуру беруть із ліктьової вени після ретельної обробки шкіри ділянки ліктьового згину в кількості 5-10 мл, з розрахунку 1:10 середовища.

Шматочки органів і біопсійну тканину збирають у дві стерильні чашки Петрі з кришкою, що закручується. Одну пробу заливають 10% формаліном для гістологічного дослідження, другу використовують для мікологічного дослідження.

Транспортування. Матеріал слід доставити в лабораторію протягом 2 год після взяття. Ліквор доставляється і зберігається при 37 ºС. Інтервал між взяттям проби і посівом не повинен перевищувати 4 год. Для молекулярно-генетичних досліджень матеріал можна зберігати до 24 год у холодильнику при +4 до -2 ºС. У разі неможливості доставки в лабораторію у встановлені терміни можна використовувати комерційні транспортні середовища.

Гістологічне дослідження

Для гістологічного дослідження з метою виявлення грибів беруть біоптати з осередків ураження у хворих і аутоптати – секційний матеріал від трупів. Candida в тканинах існує переважно в міцеліальній формі.

На даний час для виявлення грибів у тканинах використовують:

PAS (periodic-acid-Schiff) – забарвлення Шиф-йодною кислотою. Елементи гриба (дріжджові клітини, псевдоміцелій) забарвлюються в інтенсивно червоний колір. Виявляються фагоцитовані клітини грибів.
Метод Гоморі-Грокот контрасно забарвлює гриби в чорний колір на тлі навколишніх тканин, забарвлених у світло-зелений колір.
Метод Грідлі – дає від рожевого до смарагдового забарвлення дріжджових клітин, блакитне забарвлення псевдоміцелію на жовтому тлі тканин.

Серологічна діагностика

Визначення Candida у зразках сироватки крові ґрунтується на комбінації методів виявлення компонентів клітинної стінки – мананів (Platelia Candida Antigen plus [Ag Plus™]) і антимананових антитіл ([Ab Plus™]; Bio-Rad Laboratories). Чутливість і специфічність методу становить 80 і 85 % відповідно. Точність методу 50-70 % дає змогу віднести його до категорії “рекомендованого до використання” для діагностики кандидемії.

Дослідження рекомендується проводити в динаміці. Метод визначення манан/антимананових антитіл доцільно використовувати для ранньої діагностики, оскільки позитивні результати можна отримати за 6 днів до позитивної гемокультури.

У ранній діагностиці кандидозу можна використовувати виявлення β-1,3-D-глюкану, компонента клітинної стінки грибів. Однак метод не специфічний для Candida-інфекції, оскільки β-1,3-D-глюкан може бути присутнім у клітинних стінках багатьох видів грибів. Проте це один із рутинно використовуваних методів EORTC/NSR (European Organization for Research and Treatment of cancer/Mycosis Study Group) для діагностики інвазивних мікозів з 2008 року.

Найпоширенішою тест-системою для визначення глюкану є Fungitell (Associated of Cape Cod, Inc.). Чутливість методу становить ˃ 65 % для граничного (мінімального) значення глюкану 80 пг/мл, а специфічність ˃ 80 %. Призначення альбуміну, імуноглобулінів або гемодіаліз можуть давати хибнопозитивні результати. Визначення глюкану можна призначати як ранній тест дорослим пацієнтам після хірургічних втручань і тим, хто перебуває у відділеннях реанімації та інтенсивної терапії, але недоцільно для гематологічних пацієнтів. Дослідження рекомендується проводити двічі на тиждень. Діагностична значущість виявлення глюкану в дітей не підтверджена.

Молекулярно-генетичні методи

Молекулярно-генетичні методи спрямовані на визначення кількісних і якісних характеристик первинної структури ДНК грибів. Метод ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) лежить в основі всіх методів, що застосовуються для діагностики та ідентифікації мікроміцетів у клінічній практиці. Це метод прямого визначення збудника з діагностичною чутливістю 90 % і специфічністю 98 %.

Для ранньої діагностики кандидозів із нативного біологічного матеріалу можливе використання як мульти-тест систем, так і моно-тест систем. Важливим аспектом є можливість видового визначення грибів роду Candida. Однак, ПЛР-тест-системи, що виявляють тільки C. albicans, мають високу специфічність, але низьку чутливість, оскільки пропускають non-albicans види. Водночас, тест-системи для виявлення Candida spp. мають високу чутливість, але низьку специфічність, тому що виявляють види, які не мають діагностичного значення, що може призвести до отримання хибнопозитивних результатів. Широко використовуються для моно-якісного визначення C. albicans: комплекти реагентів із флуоресцентною детекцією за кінцевою точкою (“Flash” на флуориметрі “Джин”); набір “АмпліСенс®Candida albicans-FL” із детекцією за кінцевою точкою і для моно-кількісного. Для мультиплекс якісного визначення Candida spp. використовуються набори АмпліСенс C. albicans/C. glabrata/C. krusei-FL110R-F3 або Allplex™STI/BV-28(РеалБест ДНК C. albicans/C. glabrata/C. krusei). Мультиплексні кількісні набори дають змогу одночасно визначати в клінічному матеріалі гриби роду Candida (C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis) якісно і кількісно.

Для визначення видової приналежності виділених мікроміцетів референтним методом є протокол М18-А Інституту клінічних і лабораторних стандартів (CLSI), за яким ідентифікацію грибів необхідно проводити із застосуванням ПЛР із подальшим секвенуванням генів-мішеней, що мають досить різнорідний нуклеотидний склад, з високою міжвидовою дивергенцією. Метод ДНК-секвенування визнано “золотим стандартом” для видової ідентифікації мікроміцетів. За сучасними даними, видова ідентифікація за ITS-регіоном клінічних ізолятів дріжджів (включно з Candida) у 99,7 % коректна навіть для рідкісних видів, що особливо актуально у разі діагностики виду C. auris. Нині ДНК-секвенування використовують не тільки для визначення виду всередині роду, а й для типування всередині виду та вивчення набутих спадкових характеристик, таких як набуття резистентних властивостей до антимікотичної терапії.

Мікроскопія клінічного матеріалу

Матеріали зі слизових (тампони, зішкріби) – досліджують у нативних, оброблених 5-30 % КОН або забарвлених препаратах. При фарбуванні метиленовим синім або за Грамом видно бруньки і фрагменти псевдоміцелію. При додаванні до досліджуваного препарату калькофлуора білого і використанні люмінісцентної мікроскопії видно, як світяться зелені (білі, зелені, білі) елементи гриба ( клітини, які брунькуються, псевдоміцелій).

Мокротиння, випорожнення, осад рідких матеріалів досліджують у нативних препаратах або забарвлених за допомогою калькофлуора білого.

Мікоскопія дає змогу орієнтовно диференціювати гриби роду Candida від пліснявих грибів і дерматоміцетів, але не дає змоги ідентифікувати до виду.

У разі виявлення характерних елементів грибів під час мікроскопічного дослідження біоматеріалу можна опосередковано судити про стадію інфекції: псевдоміцелій утворюється у стадії інвазії та активації інфекційного процесу.

Мікологічна діагностика

Мікологічна діагностика патологічного матеріалу є основним методом при встановленні етіологічної ролі гриба в розвитку інфекційного процесу та визначення чутливості до антимікотиків.

Основні етапи:

Взяття та транспортування матеріалу
Мікроскопія матеріалу (зокрема з кольфофлюором білим).
Посів на поживні середовища: агар Сабуро, сусло-агар, бульйон Сабуро, хромогенні середовища
Отримання біомаси чистої культури для подальших досліджень
Видова ідентифікація:
- тест на ростові трубки (РТ):
  - Позитивний результат – ріст при 45 ºС: є ріст – C. albicans; немає росту – C. dubliniensis
    Негативний результат – C. не-albicans види:
- Комерційні тест-системи (біохімічні): Auxacolor 2 (BioRAD)
- Автоматичні мікробіологічні аналізатори: Vitek 2 Compact
- Фізико-хімічні методи: MALDI-TOF – мас-спектрометрія
- Молекулярно-генетичні методи: ДНК-секвенування
Визначення чутливості культури до антимікотиків.

Оскільки чутливість до протигрибкових препаратів є видозалежною – дуже важливо для адекватної протигрибкової терапії доводити ідентифікацію збудників кандидозів до виду.

Мікологічна діагностика в середньому займає 7-12 днів. Використання в практиці лабораторної діагностики нових технологій – хромогенних середовищ і MALDI-TOF – дало змогу скоротити тривалість досліджень до 3 днів і поліпшити якість діагностики. Важливим етапом залишається первинний посів біологічного матеріалу та отримання чистої культури, що безпосередньо залежить від якості поживних середовищ. Використання комерційних хромогенних середовищ дає змогу не тільки отримати ранній ріст, провести видову ідентифікацію, а й розділити культури в асоціаціях гриб-бактерія або гриб-гриб.

Визначення чутливості грибів роду Candida до протигрибкових препаратів

Визначення чутливості ізолятів Candida spp. до протигрибкових препаратів in vitro необхідно проводити при виявленні хронічних, рецидивуючих та інвазивних форм кандидозу.

Ці дослідження в рутинних лабораторних умовах доцільно проводити стандартизованими методиками CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) або EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing): CLSI M44A (диско-дифузійний метод визначення чутливості до флуконазолу і вориконазолу), а також валідованими комерційними методами: Vitek2 (BioMerieux), Sensititre YeastOne (TREK Diagnostic Systems), E-test (BioMerieux).

Під час проведення епідеміологічних досліджень або в разі сумнівних результатів, отриманих під час використання комерційних методів, рекомендується використовувати стандартизований метод CLSI М27-А3 і EUCAST EDef 7.2 (метод серійних розведень). Ключовим поняттям для визначення МІК (мінімальна інгібуюча концентрація) є найнижча концентрація антимікробного препарату, що спричиняє специфічну зупинку видимого росту. Для правильної інтерпретації результатів МІК необхідна точна видова ідентифікація.

Діагностика Candida auris

Candida auris – збудник, який важко ідентифікувати з використанням традиційних біохімічні методи. Ізоляти C. auris можуть бути помилково ідентифіковані за допомогою комерційних наборів для тестування та обладнання, найчастіше таких як Candida haemulonii, Rhodotorula glutinis або Saccharomyces cerevisiae, тому рекомендується подальша робота, якщо ці види ідентифіковані, щоб переконатися, що вони не є C. auris.

Критерії діагностики

Критерії діагностики мікозів – це поєднання специфічних клінічних, інструментальних та лабораторних ознак, що дають змогу поставити діагноз.

Безумовними критеріями діагностики інвазивних форм кандидозу є виявлення збудника під час мікроскопії та/або в посіві в стерильних у нормі біосубстратах (кров, ліквор, пунктати, біоптати тощо). Виявлення Candida spp. при мікроскопії та посіві нестерильних у нормі біоматеріалів (сеча, кал, харкотиння, нігті, виділення зі слизових оболонок тощо) є клінічно значущими тільки за наявності у пацієнта клінічних ознак.

Загальні рекомендації для діагностики захворювань, зумовлених Candida spp., зразки та методи дослідження (рекомендації ESCMID)

Автор статті: Собкова Жанна Володимирівна, бактеріолог, к. б. н., Національний військово-медичний клінічний центр “Головний військовий клінічний госпіталь”