Лікування внутрішньоклітинних інфекцій вимагає застосування антибіотиків, що володіють відповідними фармакокінетичними і фармакодинамічними властивостями в клітині. Ці властивості, однак, не можуть бути передбачені просто на основі акумуляції клітиною лікарського засобу і мінімальної інгібуючої концентрації в бульйоні. У більшості випадків внутрішньоклітинна активність фактично нижча, ніж позаклітинна активність, незважаючи на те, що всі антибіотики досягають внутрішньоклітинних концентрацій щонайменше рівних і частіше вищих, ніж позаклітинні концентрації. Ця невідповідність може бути результатом порушення реалізації антибіотичної активності або зміни чутливості бактерій усередині клітин. Тому видається важливим оцінити внутрішньоклітинну активність антибіотиків на відповідних моделях.
Ключові слова: антибіотики, клітинне накопичення, клітинна фармакодинаміка, клітинна фармакокінетика, внутрішньоклітинна інфекція
Оригінальна стаття: лінк
Автори перекладу та адаптації:
Дмитро Михайленко,
Антон Мимріков
Скорочення
AUC Площа під кривою «концентрація-час» Cmax Пікова концентрація в плазмі MBC Мінімальна бактерицидна концентрація MIC Мінімальна інгібуюча концентрація MRP Білок множинної лікарської стійкості PK/PD Фармакокінетика/фармакодинаміка
Вступ
В останні кілька років велику увагу приділяють оптимізації використання антибіотиків через тривожне підвищення бактеріальної резистентності та брак нових класів антибіотиків, що перебувають на стадії розробки [1]. У цьому контексті прогрес у галузі антиінфекційної фармакології призвів до появи нової дисципліни, що називається фармакокінетикою/фармакодинамікою (PK/PD) антибіотиків, яку визначають як «дисципліну, що займається з’ясуванням взаємозв’язку між концентрацією препаратів та ефектами, як бажаними (наприклад, загибель бактерій), так і небажаними (наприклад, побічні ефекти)» [2]. За останні 15 років було розроблено три ключові параметри PK/PD (рисунок 1; огляди див. за посиланнями [3], [6] або [7••]), які досліджують, як концентрації антибіотиків, що досягаються в рідинах організму з плином часу (як і прогнозувалося з фармакокінетичного профілю препарату) співвідносяться з потенційно ефективними концентраціями антибіотиків (що виведено з мінімальних ефективних інгібуючих концентрацій (MIC) або мінімальних бактерицидних концентрацій (MBC) антибіотиків in vitro). Перший параметр, час, за якого концентрація перевищує MIC (t > MIC), пов’язує бактерицидні ефекти з часом і критично залежить від періоду напівелімінації препарату, дозування та частоти введення протягом певного періоду часу. Другий параметр, відношення пікової концентрації в плазмі до мінімальної інгібуючої концентрації (Cmax) / MIC, пов’язує бактерицидні ефекти з концентрацією та насамперед залежить від разової дози та об’єму розподілу препарату. Третій параметр, відношення площі під кривою концентрація-час до мінімальної інгібуючої концентрації (AUC)/MIC, об’єднує обидва типи ефектів, оскільки він відображає загальну кількість лікарського засобу, на яку бактерії зазнають впливу протягом певного періоду часу, та безпосередньо залежить від загальної дози, введеної протягом цього періоду, та зворотно пропорційний до кліренсу препарату. Ці параметри, як видається, мають вирішальне значення в прогнозуванні активності антибіотиків і, отже, закладають раціональну основу дозування. Застосування цих параметрів, однак, дотепер обмежувалося позаклітинними інфекціями в добре васкуляризованих тканинах, тому що всі вони засновані на рівнях антибіотиків у сироватці крові.
Таким чином, ситуація, ймовірно, буде складнішою під час спроби передбачити активну концентрацію антибіотиків для інфекцій, що розвиваються в менш доступних компартментах, як і в разі внутрішньоклітинних інфекцій. Деякі бактерії пристосувалися виживати і навіть розмножуватися в клітинах еукаріотів [10••, 11]. У таблиці 1 перелічено найпоширеніші патогени, відповідальні за внутрішньоклітинні інфекції. Крім добре відомих облігатних або факультативних внутрішньоклітинних організмів, нині визнано, що деякі надзвичайно поширені бактерії здатні виживати внутрішньоклітинно в певних умовах. Такі інфекції вважаються «опортуністичними», оскільки досі не було виділено жодного конкретного механізму адаптації до внутрішньоклітинного виживання, і це виживання не є важливим визначальним фактором у життєвому циклі бактерій. У внутрішньоклітинному середовищі ці бактерії захищені від захисних механізмів рідинних середовищ, і, можливо, від дії антибіотиків. Отже, це може сприяти хронічному або рецидивуючому характеру інфекцій, за яких присутні внутрішньоклітинні вогнища [12, 13], що класично спостерігається для Mycobacterium або Chlamydia (див. огляди за посиланнями [14] та [15]), а також нещодавно було продемонстровано для Staphylococcus aureus [16-19], стрептококів [20, 21••], Helicobacter pylori [22] та Escherichia coli [23, 24]. Таким чином, вибір антибіотиків, що володіють внутрішньоклітинною активністю або, переважно, змішаною позаклітинною і внутрішньоклітинною активністю, видається ключовим у терапії таких інфекцій. Детальний огляд визначення параметрів клітинного PK/PD, які є прогностичними для внутрішньоклітинної активності, можна прочитати у [25]. Крім урахування впливу концентрації препарату або часу впливу на хіміотерапевтичний ефект у місці інфекції, необхідно вивчити інші параметри, які будуть специфічно модулювати відповідь у внутрішньоклітинному середовищі [10••].
Рисунок 1. Зображення основних ФК/ФД параметрів, що пов’язані зі здатністю препаратів забезпечити бажаний ефект проти внутрішньоклітинних інфекцій у контрольованих умовах
А – час (t) протягом якого концентрація зберігається вище за мінімальну інгібуючу концентрацію проти збудника (MIC). В – співвідношення між піком концентрації антибіотика в сироватці плазми крові (Cmax) і мінімальною інгібуючою концентрацією (MIC). С – співвідношення між площею під кривою «конценрація-час» (AUC) і мінімальною інгібуючою концентрацією (MIC).
Таблиця 1: Основні патогенні бактерії людини, здатні до внутрішньоклітинного існування.
Це призведе до модуляції значень MIC і MBC у клітинах, фактор, який майже ніколи не береться до уваги в контексті фармакодинаміки [26, 27] і який може призвести до вибору неадекватної терапії та ризику персистенції інфекції [28, 29•, 30].
Цілі цього огляду полягають у тому, щоб представити й обговорити поточні знання о параметрах PK/PD, від яких залежить внутрішньоклітинна активність антибіотиків, і запропонувати стратегії для оптимізації цієї активності.
Наряду з урахуванням впливу концентрації лікарського засобу або часу впливу на хіміотерапевтичний ефект у місці зараження необхідно вивчити інші параметри, які будуть специфічно модулювати відповіді у внутрішньоклітинному середовищі [10].
Клітинна фармакокінетика антибіотиків
У той час, як загальна фармакокінетика стосується надходження, розподілу, біотрансформації та елімінації препаратів в організмі, клітинна фармакокінетика зосереджена на оцінці надходження, розподілу, розпаду та ефлюксу препаратів в окремих клітинах [21••, 31, 32]. Ці дві сфери тісно пов’язані між собою, оскільки фармакокінетика препарату в клітині (наприклад, його здатність проходити біологічні мембрани, піддаватися ферментативній модифікації або транспортуванню через епітеліальні клітини) визначає його загальну долю (надходження, розподіл та елімінацію) в організмі. Вивчення фармакокінетики антибіотиків в еукаріотичних клітинах має першорядне значення, оскільки вона визначає надходження лікарського засобу у осередок інфекції.
Механізми поглинання антибіотиків, розподілу та ефлюксу в еукаріотичних клітинах
Переміщення препаратів до позаклітинних мішеней або в клітинному середовищі організму, часто проходить неспецифічними шляхами надходження, такими як дифузія або ендоцитоз, залежно від їх фізико-хімічних властивостей. Деякі препарати можуть також переноситися наявними транспортерами, які розпізнають їх, тому що вони мають деяку структурну схожість з ендогенними молекулами або нутрієнтами.
Накопичення та розподіл
Дифузія
Дифузія є найпоширенішим механізмом проходження через клітинні мембрани для молекул досить невеликого розміру (зазвичай з молекулярною масою < 700 Да) і з гарною розчинністю в ліпідах (для огляду цих загальних понять, див. посилання 33). Серед факторів, які мають критичний вплив на проникнення через мембрану, ступінь іонізації лікарського засобу, мабуть, має першорядне значення, оскільки заряджені частинки характеризуються низькою розчинністю в ліпідах і майже не здатні проходити через мембрани за відсутності специфічного механізму транспорту. Таким чином, фактична швидкість дифузії лікарського засобу варіюватиметься залежно від рН довкілля, при цьому слабкі основи дифундують швидше при лужному рН, ніж при кислому рН, а слабкі кислоти поводяться навпаки. У результаті слабкі основи мають тенденцію накопичуватися у пов’язаних із мембранами кислотних компартментах, тоді як слабкі кислоти виводяться з цих ділянок (обговорення цих загальних концепцій див. у посиланні [34], а застосування в субклітинних компартментах див. у посиланні [35]).
Вважається, що β-лактамні антибіотики всередину клітини проникають через клітинну мембрану шляхом пасивної дифузії. Рівноважна концентрація цих антибіотиків стає рівною по обидва боки мембрани, що призводить до фактора накопичення приблизно 1 [36-38]. Однак, будучи слабкими кислотами, β-лактами значною мірою витісняються з лізосом і аналогічних кислих вакуолей (досить погано накопичуються в лізосомах і аналогічних кислих вакуолях). Хінолони, імовірно, також проникають у більшість клітин шляхом простої дифузії, але в стані рівноваги вони концентруються всередині клітин, більше, ніж ззовні, з причин, які досі нез’ясовані [39, 40•, 41, 42]. Макроліди входять до числа антибіотиків з найвищою ємністю накопичення в еукаріотичних клітинах. Через свій слабкий основний характер, макроліди, що надійшли в клітини, в їх позитивно зарядженій, мало дифундуючій, формі, значною мірою захоплюються лізосомами, причому дицинові молекули (наприклад, азитроміцин, еритроміциламін та телітроміцин) досягають більш високих рівнів накопичення, ніж монокатіонні молекули (наприклад, еритроміцин, рокситроміцин, кларитроміцин та цетроміцин) [44-47, 48•].
Ендоцитоз
Ендоцитоз є неспецифічним механізмом, за допомогою якого молекули, які погано дифундують (тобто молекули, які є надто об’ємними або надто полярними), потрапляють у лізосоми. Адсорбція на клітинній поверхні або специфічна взаємодія з поверхневими рецепторами може значно прискорити швидкість та ефективність процесу поглинання (див. огляд за посиланням [49]).
Аміноглікозиди є найбільш типовим прикладом антибіотиків, які потрапляють у клітини (нирок та вуха) через подвійний процес адсорбції та рецептор-опосередкованого ендоцитозу. Ці високополярні молекули поліамінуються і зв’язуються з негативно зарядженими фосфоліпідами мембрани та ендоцитарним рецептором мегаліну. Мегалін – це білок, який діє як рецептор для поліамінованих сполук, і він особливо поширений у проксимальних канальцях нирок, а також у волоскових клітинах внутрішнього вуха (див. огляд за посиланням [50]). Глікопептиди, які є об’ємними молекулами, також проникають у клітини цим ендоцитарним шляхом, і їхній рівень накопичення в лізосомах значно варіюється залежно від типу глікопептиду. Амфифільні глікопептиди, такі як тейкопланін, далбаванцин, телаванцин або орітаванцин, досягають набагато більш високих рівнів накопичення в клітинах, ніж більш гідрофільні молекули, такі як ванкоміцин [51-53]. Цей ефект особливо виражений у випадку орітаванцину, внутрішньоклітинна концентрація якого в кілька сотень разів перевищує позаклітинну концентрацію, що, як передбачається, є результатом високого рівня адсорбції молекули на поверхні клітини.
Транспорт всередину клітини
Транспорт препаратів всередину клітини спостерігається для молекул, які мають достатню схожість з ендогенними субстратами транспортерів. Транспорт антибіотиків всередину клітини був продемонстрований на поверхні епітелію. Цей механізм внутрішньоклітинного накопичення сприяє всмоктуванню в кишечнику або реабсорбції клітинами канальців нирок і, тому, регулює фармакокінетичний профіль антибіотиків. Всмоктування β-лактамів із кишківника (пептидоміметичних препаратів, що виконують функцію вільних кислот) опосередковано транспортерами невеликих пептидів (наприклад, PEPT1 [54, 55]) або монокарбоксилатних сполук (наприклад, MCT1, пептидний транспортер PEPT2 [54, 55]) та переносниками органічних іонів, такі як OCTN2 [57]. Варто зазначити, що існує величезна варіабельність у розпізнаванні різних β-лактамів цими переносниками [55], що може пояснити значні відмінності в пероральній біодоступності або швидкості виведення цих антибіотиків. Також припускається, що активний транспорт відбувається в неполяризованих фагоцитарних клітинах. Наприклад, було висловлено припущення, що транспортери пуринів сприяють накопиченню хінолонів (біциклічних ароматичних ядер) у моноцитах [58].
Еффлюкс
Еффлюкс-транспортери, що розміщуються на поверхні еукаріотичних клітин, беруть участь у виведенні або полярних метаболітів, що не дифундують і утворюються в клітинах, або дифундуючих молекул, здатних вільно проникати в клітини. Ці транспортери зазвичай володіють широкою субстратною специфічністю, будучи в змозі розпізнавати молекули переважно на основі їхньої амфифільності та наявності функціональних груп, що піддаються іонізації. Серед цих переносників повсюдно поширені переносники широкого спектра лікарських засобів суперсімейства аденозинтрифосфату (АТФ) (ABC) (включно із білком P-глікопротеїном (P-gp) множинної лікарської стійкості та білками множинної лікарської стійкості (MRP)), в той час як переносники органічних катіонів або аніонів в основному виявляються на поверхні епітелію [60]. У разі експресії в неполяризованих клітинах переносники широкого спектра лікарських засобів зменшують накопичення ліків у клітині і, отже, впливають на фармакологічну активність ліків щодо внутрішньоклітинних мішеней. Для антибіотиків було показано, що цей транспорт шкідливо впливає на внутрішньоклітинну активність [61]. При локалізації на поверхні біологічних бар’єрів, таких як кишківник, гематоенцефалічний бар’єр, печінка і нирки, ефлюкс-переносники сприяють зниженню абсорбції ліків, поганому проникненню в центральну нервову систему або прискореному виведенню печінкою або нирками, що робить субоптимальними сироваткові концентрації ліків [60, 62].
Припускають, що P-gp бере участь у транспорті β-лактамів, макролідів, хінолонів, тетрациклінів, стрептограмінів і триметоприму, а також вважають, що MRPs транспортують β-лактами, макроліди, хінолони та рифаміцини на рівні епітеліальних клітин, які утворюють біологічні бар’єри, або фагоцитуючі чи трансфіковані клітини (див. посилання [60] та посилання, наведені в ньому). Крім того, різні типи переносників органічних аніонів сприяють реабсорбції β-лактамів у ниркових канальцях і перешкоджають їхньому проникненню в центральну нервову систему [63, 64].
Рівні накопичення та субклітинного розподілу основних класів антибіотиків в еукаріотичних клітинах
У таблиці 2 узагальнено сучасні знання про фармакокінетику антибіотиків в еукаріотичних клітинах. Макроліди та напівсинтетичні глікопептиди накопичуються в клітинах у вищих концентраціях, ніж інші антибіотики, але в основному концентруються в лізосомальних вакуолях [44, 45, 51]. Хінолони накопичуються в помірних концентраціях і знаходяться в цитозолі, можливо, через їхню високу дифузійність. Лінкозаміди та рифаміцини також концентруються в еукаріотичних клітинах, але їх локалізація невідома [65, 66]. Клітинна концентрація всіх цих класів антибіотиків буде вищою, ніж концентрація в сироватці крові, що свідчить про потенціал для лікування внутрішньоклітинних інфекцій, розташованих у компартменті, де концентрується препарат. Відповідно, макроліди, рифаміцини та хінолони класично вважаються препаратами вибору для лікування внутрішньоклітинних інфекцій [43, 67-71]. β-Лактами проникають, але не накопичуються в клітинах, при цьому клітинні концентрації близькі до позаклітинних концентрацій, і тому зазвичай вважається, що вони не становлять інтересу для лікування внутрішньоклітинних інфекцій [72-74]. Однак, оскільки сироваткові рівні для цього класу антибіотиків часто доволі високі (пікові рівні 50 мг/л), в умовах їхнього клінічного використання можна очікувати, що клітинні концентрації будуть вищими, ніж MIC для внутрішньоклітинних патогенів. Відповідні дози (тобто високі концентрації) та тривалий час утримування їх (що підтверджується залежною від часу активністю β-лактамів у позаклітинних моделях інфекцій) можуть, таким чином, компенсувати нестачу накопичення та забезпечити внутрішньоклітинну активність β-лактамів, як нещодавно було продемонстровано на моделях in vitro [75•, 76••]. Аміноглікозиди повільно накопичуються в клітинах, тож вони досягають активних концентрацій лише за тривалої експозиції. Тому вони використовуються при лікуванні хронічних внутрішньоклітинних інфекцій, таких як туберкульоз [77].
Клітинна фармакодинаміка антибіотиків
Ґрунтуючись тільки на фармакокінетичних міркуваннях, може виникнути спокуса зробити висновок, що внутрішньоклітинна активність антибіотиків може бути передбачена за рівнем їх накопичення. Однак при екстраполяції даних, отриманих на клітинних моделях, для ситуації in vivo, більш точне уявлення буде отримано при розгляді клітинних концентрацій, а не показників накопичення, оскільки цей параметр також враховує той факт, що сироваткові концентрації антибіотиків можуть значно відрізнятися між класами. Деякі значення клітинної концентрації наведені в таблиці 2, хоча деякі можуть бути завищені для антибіотиків, що мають високий ступінь зв’язування з білками, бо це по суті лише вільна фракція, яка може потрапити в клітини.
Також варто зазначити, що локальні концентрації в певних компартментах можуть бути вищими для антибіотиків, які не розподілені рівномірно по всьому об’єму клітин. Незважаючи на те, що концентрації всіх антибіотиків у клітинах, мабуть, значно перевищують значення MIC для чутливих мікроорганізмів, дослідження, в яких систематично порівнюють позаклітинну і внутрішньоклітинну активність антибіотиків різних класів, привели до двох несподіваних спостережень. По-перше, не існує простої кореляції між клітинними концентраціями антибіотиків і внутрішньоклітинною активністю [10••, 76••, 78••, 79, 80]. Цю концепцію проілюстровано на рисунку 2 (панелі A і B), на якому розглядають внутрішньоклітинну активність низки антибіотиків відносно бактерій, які перебувають у цитозолі (Listeria monocytogenes) і фаголізосомах (S. aureus), і представлено як функцію логарифма концентрації у макрофагах THP1, визначеної у клітинах, що зазнавали впливу ззовні кожним препаратом упродовж 24 годин у концентрації, що відповідає Cmax у людини. Проти L. monocytogenes більшість протестованих антибіотиків досягали клітинної концентрації від 10 до 100 мг/л, але виявляли різні ефекти від неактивності (бактерії росли) до зниження кількості бактерій (-4 log). Орітаванцин, який накопичувався більшою мірою, був майже неактивний щодо внутрішньоклітинної L. monocytogenes, але це можна пояснити ґрунтуючись на його локалізації в лізосомах (цим також можна пояснити неактивність гентаміцину). Ґрунтуючись на цьому поясненні, не дивно, що орітаванцин є активним щодо внутрішньоклітинно розташованих S. aureus; однак, він не є більш бактерицидним, ніж інші лікарські засоби, що мають нижчу клітинну концентрацію, такі як хінолони. По-друге, хоча концентрації в клітинах, як правило, вищі, ніж позаклітинні концентрації, активність антибіотиків може бути нижчою внутрішньоклітинно, ніж позаклітинно, принаймні проти бактерій у фаголізосомах, таких як S. aureus. Позаклітинна і внутрішньоклітинна активність тих самих антибіотиків, що й на рис. 2, корелюють на рис. 3. Однак проти L. monocytogenes внутрішньоклітинна активність антибіотиків нижча, схожа (наприклад, для хінолонів) або навіть вища (наприклад, для деяких β-лактамів), ніж позаклітинна активність. Важливо зазначити, що макроліди, які входять до переліку антибіотиків, що накопичуються в клітинах на вищому рівні, мають погану внутрішньоклітинну активність (див. посилання [69]), ймовірно, через властиві їм бактеріостатичні властивості.
Таблиця 2. Клітинна фармакокінетика основних класів антибіотиків в еукартіотичних клітинах
a – Ступінь акумуляції в рівноважному стані Сс/Се – являє собою коефіцієнт кумуляції (тобто співвідношення між внутрішньоклітинною Сс і позаклітинною Се концентрацією) в культурі макрофагів. b – Розраховано за співвідношенням кумуляції в культурі макрофагів із використанням як значення Ce середньої Cmax у людини для досліджуваного антибіотика. c – Глікопротеїн Р (P-gp) та білки множинної лікарської резистентності (MRPs) належать до АВС суперсімейства білків транспортерів, що активуються гідролізом АТФ, які експресуються в епітеліальних і фагоцитуючих клітинах. Катіонні, аніонні та пептидні танспортери належать до різних родин, але всі вони активуються іонним градієнтом і експресуються переважно в епітеліальних клітинах. Таблиця 2 базується на даних з оглядів [10••, 32, 60].
Рисунок 2. Взаємозв’язок між внутрішньоклітинною активністю антибіотиків та їхньою клітинною концентрацією
Діаграми демонструють внутрішньоклітинну активність груп антибіотиків проти Listeria monocytogenes (ліворуч) і Staphylococcus aureus (праворуч) на моделі ТН1 макрофагів людини. Активність показана як зміна кількості бактерій після 24 годин експозиції (або 5 годин експозиції орітаванцину на моделі L. monocytogenes) кожного з обраних антибіотиків при позаклітинній концентрації, яка відповідає таковій Cmax у людини. Клітинні концентрації були виміряні в тих самих умовах і представлені в значеннях логарифма від мг/л (графіки А і В) або логарифма однотипних показників MIC, що визначався в бульйоні за рН, відповідного до компартменту, в якому локалізується інфекція (графіки С і D). Блакитна зона відноситься до загибелі бактерій, тоді як точкова лінія показує межу бактерицидного ефекту (-2 log згідно з рекомендаціями Інституту Клінічних та Лабораторних Стандартів). Межа визначення була -4,2 log, а всі показники нижче цієї межі були встановлені як -5 log. Діаграми засновані на даних з оглядів [75•], [76••] і [107].
AMP – ампіцилін, AZM – азитроміцин, CFU – колонієутворюючі одиниці, CIP – ципрофлоксацин, ETP – ертапенем, GEN – гентаміцин, GRN – гереноксацин, LNZ – лінезолід, LVX – левофлоксацин, MEM – меропенем, MXF – моксифлоксацин, NAF – нафцилін, ORI – орітаванцин, OXA – оксацилін, PEN V – пеніцилін V, RIF – рифампіцин (рифампін), TEC – тейкопланін, TEL – телітроміцин, VAN – ванкоміцин.
Загальна низька внутрішньоклітинна активність деяких антибіотиків може бути наслідком: (і) поганої біодоступності акумульованого антибіотика, що робить фармакокінетичні прогнози некоректними; або (іі) зміни MIC у бік більш високих значень у внутрішньоклітинному середовищі, підкреслюючи важливість фармакодинамічних міркувань. Такі зміни в MIC можуть бути спричинені або порушенням антибактеріальної активності у внутрішньоклітинному середовищі, або зміненою чутливістю бактерій в еукаріотичних клітинах.
Клітинна біодоступність антибіотиків
У позаклітинних моделях активність найкраще прогнозується з огляду на вільну концентрацію антибіотиків у сироватці, яка являє собою фракцію, що дифундує в тканини і досягає бактеріальних мішеней. Відсутність кореляції між загальною кількістю антибіотиків у клітинах і внутрішньоклітинною активністю може свідчити про те, що частина накопиченого препарату не є біодоступною через зв’язування з компонентами клітини. Взаємодія антибіотиків із клітинними білками досі не зафіксована в літературі, але є досить імовірною. Однак, відомо, що макроліди, а також орітаванцин, міцно зв’язуються з ліпідними компонентами мембран, призводячи навіть до ліпідних відкладень у лізосомах [46, 82, 83].
Рисунок 3. Співвідношення між внутрішньоклітинною та позаклітинною активністю антибіотиків
Діаграма показує співвідношення між внутрішньоклітинною та позаклітинною активністю груп антибіотиків проти Listeria monocytogenes (графік A) і Staphylococcus aureus (графік B), на моделі макрофагів людини THP1. Активність показано як зміну кількості бактерій після 24 годин експозиції (або 5 годин експозиції орітаванцину на моделі L. monocytogenes) для кожного з обраних антибіотиків при позаклітинній концентрації, яка відповідає таковій Cmax у людини, як позаклітинно (вісь Х), так і в інфікованих макрофагах (вісь Y). Блакитна зона відноситься до загибелі бактерій, тоді як точкова лінія показує межу бактерицидного ефекту (-2 log згідно з рекомендаціями Інституту Клінічних і Лабораторних Стандартів). Межа визначення була -4,2 log, а всі показники, нижчі за цю межу, були встановлені як -5 log. Діагональна лінія розділяє експериментальні точки, очікувані для препаратів, що демонструють однакову позаклітинну та внутрішньоклітинну активність, причому точки вище цієї лінії відповідають бактерицидній активності, що є вищою внутрішньоклітинно, ніж позаклітинно, і нижче лінії для активності, що є вищою позаклітинно, ніж внутрішньоклітинно. Діаграми засновані на даних з оглядів [75•], [76••] і [107].
AMP – ампіцилін, AZM – азитроміцин, CFU – колонієутворюючі одиниці, CIP – ципрофлоксацин, ETP – ертапенем, GEN – гентаміцин, GRN – гереноксацин, LNZ – лінезолід, LVX – левофлоксацин, MEM – меропенем, MXF – моксифлоксацин, NAF – нафцилін, ORI – орітаванцин, OXA – оксацилін, PEN V – пеніцилін V, RIF – рифампіцин (рифампін), TEC – тейкопланін, TEL – телітроміцин, VAN – ванкоміцин.
Внутрішньоклітинні прояви антибіотичної активності
Вплив довкілля на активність антибіотиків може бути частково врахований шляхом побудови графіка залежності активності від клітинної концентрації, вираженої в кратних значеннях MIC, що визначаються за нейтрального рН для L. monocytogenes у цитозолі, але за кислого рН для S. aureus у фаголізосомах. Рисунки 2C і 2D показують, що в кислому середовищі ця корекція негативно впливає на клітинну концентрацію макролідів, гентаміцину та, меншою мірою, хінолонів, але підвищує клітинну концентрацію рифампіну та, певною мірою, β-лактамів, не змінюючи при цьому клітинну концентрацію глікопептидів та лінезоліду. Ця корекція, однак, не покращує кореляцію між клітинною концентрацією та внутрішньоклітинною активністю, даючи змогу припустити, що вплив клітинного середовища виходить за рамки впливу pH.
Серед інших факторів, специфічних для внутрішньоклітинного середовища фагоцитів, механізми захисту клітин можуть або сприяти, або протидіяти антибіотичній дії. Наприклад, інгібування “кисневого вибуху” в макрофагах знижує внутрішньоклітинну активність хінолонів проти L. monocytogenes, що дає змогу припустити, що оксиданти посилюють ефективність цього класу антибіотиків [84]. Навпаки, глобальне порушення клітинних механізмів захисту не запобігає несподіваному внутрішньоклітинному бактерицидному ефекту β-лактамів проти L. monocytogenes [85], що дає підстави припустити, що бактерії володіють підвищеною сприйнятливістю до цих антибіотиків у клітинах.
Внутрішньоклітинна бактеріальна чутливість до антибіотиків
Бактерії, здатні до росту всередині еукаріотичних клітин, можуть зазнати радикальних змін у їхньому метаболізмі, щоб адаптуватися до нового, а інколи й ворожого середовища клітин порівняно з позаклітинним середовищем. Такі зміни були добре охарактеризовані для облігатних і факультативних бактерій, які повинні виробляти додаткові білки, щоб вирватися з фагосоми та рухатися в цитозолі (як спостерігається для Listeria або Shigella [86, 87]) або для запобігання злиттю фагосоми з лізосомами для забезпечення можливості фагосомної інфекції (як спостерігається для легіонел або хламідій [88]). Нещодавні дослідження, що досліджують, у глобальному порядку, генетичні прояви або білкові профілі внутрішньоклітинних бактерій або бактерій, які зазнали впливу помірно кислого середовища, продемонстрували численні метаболічні зміни [89-91]. Ймовірно, що деякі з цих змін можуть впливати на дію антибіотиків, як було імовірно описано вище, що може пояснити підвищену чутливість внутрішньоклітинної лістерії до β-лактамів. Крім того, швидкість росту деяких бактерій зазвичай знижується всередині клітин [92-94], що підкреслює їхню необхідність адаптуватися до агресивного середовища. Ця затримка росту може сприяти порушенню антибіотичної активності, оскільки багато класів антибіотиків впливають на бактерії на активній стадії розмноження, що демонструється залежною від фази розвитку ефективністю антибіотиків проти хламідій [95]. Крім того, локальний рН може впливати не тільки на дію антибіотиків, а й на бактеріальну відповідь на антибіотики. Дивовижним прикладом цього є метицилінрезистентний S. aureus, який стає чутливим до β-лактамів внутрішньоклітинно [96], ймовірно, через сприятливий вплив кислого рН. Нарешті, механізми резистентності можуть впливати на бактеріальну відповідь на антибіотики, хоча невідомо, як внутрішньоклітинне середовище може впливати на експресію індуцибельних механізмів. Серед таких механізмів гіперпродукція ефлюксних насосів є широко поширеною і сприяє стійкості до антибіотиків як у грампозитивних, так і в грамнегативних бактерій, у тому числі в патогенних мікроорганізмах, здатних виживати всередині еукаріотичних клітин. Продукція ефлюксних насосів, по суті, ґрунтується на тій ролі, яку вони відіграють у бактеріальній вірулентності або виживанні всередині хазяїна, що продемонстровано для грамнегативних бактерій [99, 100]; проте чи продукуються ефлюксні насоси in vivo, все ще обговорюється. У цьому контексті дуже бажаними є дослідження, спрямовані на встановлення того, як здійснюється продукція бактеріальних ефлюксних насосів в еукаріотичних клітинах і чи знижують вони концентрацію, а, отже, активність антибіотиків у цих компартментах.
Стратегії оптимізації внутрішньоклітинної активності антибіотиків
Оптимізація клітинної фармакокінетики
Хоча кореляції між накопиченням як таким і активністю не існує, внутрішньоклітинна активність конкретного антибіотика може бути оптимізована шляхом максимізації його клітинної концентрації та часу впливу. Цей ефект ілюструється на рис. 4 (графік A), на якому показано вплив часу і концентрації на активність β-лактаму щодо L. monocytogenes. Активність розвивається сигмоїдально залежно від концентрації, а виражений бактерицидний ефект досягається тільки за високих концентрацій і тривалого впливу антибіотиків. Таким чином, стратегії, спрямовані на оптимізацію вмісту препарату в клітинах протягом тривалого часу, можуть поліпшити внутрішньоклітинну активність.
У випадку β-лактамів, які не накопичуються значною мірою в еукаріотичних клітинах, відповідні хімічні модифікації можуть змінити їхній клітинний фармакокінетичний профіль і сприяти їхньому поглинанню еукаріотичними клітинами. Наприклад, приєднання слабкої основної функціональної групи та маскування кислого характеру пеніциліну робить молекулу схильною до накопичення в лізосомах [37], тоді як маскування кислого характеру ампіциліну через ефірне проліки, що розчиняються, помітно збільшує клітинну концентрацію вільного ампіциліну, так само як і його активність щодо внутрішньоклітинної L. monocytogenes [38]. У випадку аміноглікозидів, які повільно накопичуються в клітинах, використання відповідної лікарської форми, такої як мікросфери, що містять антибіотики, покращує внутрішньоклітинну активність за рахунок збільшення фагоцитарної порції препарату [101, 102]. Ця стратегія також ефективна для підвищення ефективності рифампіну щодо Mycobacterium tuberculosis, завдяки повільному вивільненню препарату всередині інфікованих клітин [103].
З іншого боку, для антибіотиків, що виводяться з клітин активними ефлюксними механізмами, інгібування відповідних транспортерів підвищує вміст препаратів у клітині та, як наслідок, внутрішньоклітинну активність. Проявом цього є збільшення активності хінолонів проти L. monocytogenes у присутності гемфіброзилу або збільшення активності макролідів як проти L. monocytogenes, так і S. aureus, коли клітини піддаються впливу верапамілу [104, 105].
Рисунок 4. Вплив часу та концентації на внутрішньоклітинну активність антибіотиків
А – Показано вплив часу і концентрації на внутрішньоклітинну активність ампіциліну проти Listeria monocytogenes в інфікованих макрофагах THP1 з експозицією від 5 до 24 годин при зростанні концентрації препаратів, показаної як логарифм їхньої мінімальної інгібуючої концентрації (MIC). В – Представлено порівняння залежності «доза-ефект» для активності ампіциліну та моксифлоксацину проти Staphylococcus aureus в інфікованих макрофагах THP1, підданих упродовж 24 год впливу зростаючих кратних значень MIC цих антибіотиків. Блакитна зона відноситься до загибелі бактерій, тоді як крапкова лінія показує границю бактерицидного ефекту (-2 log згідно з рекомендаціями Інституту Клінічних і Лабораторних Стандартів). Діаграми ґрунтуються на даних з оглядів [75•], [76••] та [78••].
Врахування клітинної фармакодинаміки
Наразі ми маємо лише часткове уявлення про фактори, що впливають на активність антибіотиків або чутливість бактерій до антибіотиків усередині клітин. Вибір антибіотиків має ґрунтуватися на даних MIC, які визначають за рН компартмента, у якому розвивається інфекція [76••, 80, 96]. Однак було зазначено, що, крім рН, на внутрішньоклітинну активність антибіотиків впливають багато параметрів, отже, остаточний вибір препарату також має ґрунтуватися на дослідженнях у відповідних клітинних моделях in vitro, у яких оптимізовано фармакокінетичні параметри. Це показано на рисунку 4 (графік B), де порівнюється залежність «доза-ефект» двох антибіотиків з однаковими MIC проти внутрішньоклітинного S. aureus протягом 24 годин при нейтральному pH. Фармакологічні реакції, як видається, відрізняються за максимальним ефектом і значеннями EC50, що свідчить про важливість вивчення бактеріальної відповіді на препарат у фізіологічному середовищі.
Розробка відповідних моделей
Необхідно розробити моделі, які б точно імітували клінічні умови застосування антибіотиків з погляду концентрації та впливу антибіотика, і які об’єднують ці фармакокінетичні параметри з фармакодинамічними аспектами. Наразі більшість моделей in vitro використовують постійні статичні концентрації антибіотиків, але модулюють або час впливу, або позаклітинну концентрацію [26, 69, 75•, 76••, 78••, 94, 106-109]. Ці сучасні моделі можуть бути придатними для вивчення впливу комбінацій антибіотиків на фармакокінетику (наприклад, конкуренція за транспортні системи [110]) і фармакодинаміку (наприклад, синергізм або антагонізм [111-113]). Крім того, моделювання зміни концентрацій антибіотиків у часі з використанням динамічних моделей in vitro (рис. 1) може допомогти більш точно відтворити фактичний вплив інфікованих клітин на антибіотики. Однак нині в моделях in vitro часто використовують факультативні внутрішньоклітинні патогени, які вирощують на бульйоні [114, 115••, 116]. Більш реальною ситуацією була б розробка динамічних моделей з бактеріями, що ростуть усередині еукаріотичних клітин [117••]. Нещодавні зусилля були також спрямовані на розробку методологій, що забезпечують чутливе та швидке виявлення внутрішньоклітинних бактерій [118••, 119••], або на рутинну оцінку внутрішньоклітинної ефективності антибіотиків [120, 121]. Ці типи досліджень мають бути включені в ранню розробку нових антибіотиків, особливо якщо їхній спектр активності включає бактерії, здатні виживати внутрішньоклітинно (наприклад, див. посилання [51], [69] та [122]-[125]).
Моделі in vivo були розроблені для кількох опортуністичних або факультативних бактерій (126-129), і вони необхідні для оцінки терапевтичних схем, створених на основі даних in vitro, для правильного розв’язання питань біодоступності ліків і оцінки спільної дії з механізмами захисту організму-господаря. У цьому відношенні пряме вимірювання внутрішньоклітинних концентрацій антибіотиків in vivo за допомогою неінвазивних підходів [130•] дозволить досягти значного прогресу у встановленні кореляції активності з фактичною концентрацією лікарського засобу в інфікованій ділянці. Моделі in vivo можуть підтвердити непередбачувану внутрішньоклітинну активність, спостережувану in vitro, як, наприклад, у випадку нового похідного етамбутолу, що виявився настільки ж активним in vivo, як і in vitro проти M. tuberculosis в інфікованих клітинах, і продемонстрував високу тканинну концентрацію, незважаючи на низьку пероральну біодоступність [131], або для хінолонів, що виявилися ефективними in vivo проти L. monocytogenes [132], відповідно до їхньої поведінки in vitro в інфікованих макрофагах [78••]. Моделі in vivo також можуть допомогти забезпечити глибше розуміння фармакокінетичних проблем, відповідальних за відсутність ефективності, як-от неналежне дозування β-лактаму мецилінаму (який створює концентрації, що залишаються вищими за MIC лише упродовж 6-7 год), що пов’язано із внутрішньоклітинним виживанням E. coli [29•], або погана біодоступність аміноглікозидовмісних мікросфер, які спочатку виглядали багатообіцяючими in vitro щодо Brucella abortus, але виявилися надзвичайно розчаровуючими in vivo [133].
Висновок
Акумуляцію антибіотиків у клітині довгий час вважали предиктором активності проти внутрішньоклітинних інфекцій. Цю концепцію необхідно переглянути, ґрунтуючись на нещодавніх спостереженнях про те, що прояви активності антибіотиків та чутливість бактерій може бути значно змінена у внутрішньоклітинному середовищі. Тому активність слід тестувати на відповідних моделях внутрішньоклітинних інфекцій, які враховують необхідні фактори фармакокінетики (наприклад, час впливу та концентрації, досяжні in vivo) і які можна використовувати для дослідження параметрів, що модулюють фармакодинамічну поведінку.
Подяка
Д-р Ван Бамбеке є фахівцем Chercheur Qualifié Національного наукового фонду Бельгії, а Сандрін Лемер – докторантом Бельгійського фонду досліджень промисловості та сільського господарства. Експериментальне дослідження, що поклало початок концепціям, представленим у цьому огляді, підтримано бельгійським фондом наукових досліджень «Медікал» та 5-ю програмою «Pôles d’Attraction Interuniversitaires / Interuniversitaire Attractie Polen».
Список літератури наведено на 2-й сторінці.